卵白修饰位点的浮滑设施 众人在进行卵白翻译修饰照看的期间，第一步经常分为两种情况：对已知或仍是报说念的位点进行筛查，或对未知的新位点进行从新浮滑，以笃定和我方照看磋磨的候选位点。 凭证卵白修饰照看场所和需求不同，卵白修饰位点的浮滑设施梗概可分为质谱浮滑法和抗体芯片筛选分析法两种。因为 CST 主要专注于以质谱分析为基础的高通量浮滑设施，是以本文麇集先容卵白修饰的质谱浮滑旨趣和设施。 质谱浮滑法旨趣及经由 在往日 20 年来，质谱分析已成为笃定卵白质修饰类型和位点的必不可少的器用。质谱分析可用于纯化的卵白质或卵白质搀杂物（如细胞裂解液）。用卵白内切酶（如胰卵白酶）把某单一卵白或卵白搀杂物消化成小分子多肽片断，然后经富集和纯化后，运用质谱分析这些多肽片断，以笃定其 m/z 值（质荷比）。由于酶切位点是已知的，是以就不错用遐想机法式，凭证质料笃定每个肽段的特定氨基酸序列。由于磷酸基瓜分子的分子量和电荷是已知的，是以也不错检测肽段中特定氨基酸的磷酸化。因此，质谱可用于多肽氨基酸序列的笃定、多肽和卵白质的分子量测定、多肽和卵白质的相对定量和翻译后修饰的检测。 关于修饰肽段和翻译后修饰的分析，先用反相色谱差异多肽，然后馏分采集和用质谱分析 (LC/MS)。为了更准确地笃定肽段修饰的性质，经常用串联质谱 (MS/MS) 本质。 第一个 MS 法子后，用惰性气体撞击多肽离子，从而导致进一步的碎屑化。然后在第二个 MS 法子分析这些多肽片断。在此过程中，有些修饰肽段将保捏不变，产生的肽段现象肖似于未相撞的肽段，toutoulu有些肽段将显赫碎屑化，产生的肽段现象不错为修饰氨基酸的性质和位点提供进一步的信息。 质谱的更多用途 质谱既可被用来笃定单一卵白质的修饰气象，还被用来笃定带有某种特定修饰（如磷酸化）的扫数卵白质的凡俗数据集。这种时期被用于笃定带有这种修饰的「亚卵白质组」，举例磷酸化卵白质组分析癌症中扫数这个词信号麇集的激活气象。 质谱浮滑的局限 可是，现在质谱分析还存在一些局限，弗成弥散检测扫数多肽片断，有些肽段明晰可见，有些肽段不可见，这关于复杂搀杂物的分析平素是一个主要问题。另外，由于卵白质修饰的品貌低以及离子化后果低，带有某种修饰的肽段质谱信号会被无修饰的肽段质谱信号压制，因此在卵白修饰的质谱分析浮滑前，依然需要荟萃富集时期以便于进步信噪比，这平素波及到质谱分析前的亲和层析。 富集设施 不同类型修饰有不同的富集设施，如表 1 所示。  

PTM 类型色五月第二季

富集设施

磷酸化

金属离子亲和层析（IMAC， TiO2） Motif 抗体富集

酰化（如乙酰化等）

Motif 抗体富集

甲基化

Motif 抗体富集

泛素化和类泛素化

Motif 抗体富集 含有标签序列的泛素或类泛素化抒发载体转入细胞，运用标签抗体富集泛素或类泛素化卵白

 

「什么是基序抗体呢？和修饰位点特异性抗体有什么不同呢？」 基序，英文是 motif，亦称模序、模体，是指 DNA、卵白质等生物大分子中的保守序列或适合一定陈列司法的核苷酸或氨基酸组合。关于卵白修饰位点来说，基序（motif）经常指某种修饰所一语气的氨基酸残基周围序列的陈列司法。比如，Phospho-PKASubstrate (RRXS*/T*) (100 G7E) Rabbit mAb #9624，PKA（卵白激酶 A）在其底物的 (R)(R)X(S/T) 序列进行特异性磷酸化，这个序列的特征是在磷酸化修饰的丝氨酸/苏氨酸（S/T）的 -2 和 -3 位经常为精氨酸（R），而 X 代表丝氨酸/苏氨酸（S/T）的-1 位不错是恣意氨基酸。那么，大要识别这些不同基序（即多样修饰所在位点及周围氨基酸多样陈列组合）的抗体就叫作念 motif 抗体。 和圭臬的位点特异性修饰抗体（如 Phospho-Akt(Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060）不同，motif 抗体是识别修饰所在位点及周围氨基酸多样陈列组合的抗体，大要识别的潜在卵白修饰肽段相当多。而圭臬的位点特异性修饰抗体是精准识别某一个卵白的某一个特定修饰位点（修饰位点周围的氨基酸序列亦然笃定的）的抗体。 CST 是最早运转研发基序（motif）抗体的公司，并在往日十多年建造出一系列大要识别这些不同修饰位点基序的 motif 抗体，大大激动了运用质谱对卵白多样修饰位点信息的高通量分析。诚然，CST 的位点特异性修饰抗体的种类相当多，达 20 多种，针对 1000 多个靶点，援用文件巨额。因此，CST 获取了 CiteAb 2017 「PTM antibody of the Year」（卵白翻译后修饰抗体的援用文件占有率在 65% 以上）。 具体而言，CST 提供好多用于在质谱分析前对不同类型修饰肽段进行富集及老例分析的试剂（见表 2~表 6）。  

表 2：磷酸化修饰肽段富集磋磨抗体试剂 

磷酸化修饰肽段 IP 富集试剂盒（用于卵白组学分析）

居品货号

居品称号

规格

75676

PTMScan® Multi-Pathway Enrichment  Kit

10 次 IP

8803

PTMScan(R) Phospho-Tyrosine Rabbit mAb  (P-Tyr-1000) Kit

10 次 IP

5636

PTMScan(R) Phospho-Tyrosine Mouse mAb  (P-Tyr-100) Kit

10 次 IP

14478

PTMScan(R) Pilot Phospho-Tyrosine  Rabbit mAb (P-Tyr-1000) Kit

3 次 IP

91336

PTMScan(R) Phospho-Thr-X-Arg Motif  [pT(P/X)R] Kit

10 次 IP

5567

PTMScan(R) Phospho-T*PP Motif (T*PP)  XP(R) Rabbit mAb Kit

10 次 IP

5566

PTMScan(R) Phospho-ST*P Motif (ST*P)  XP(R) Rabbit mAb Kit

10 次 IP

14989

PTMScan(R) Phospho-Ser-Pro-Pro Motif  [pSPP] Kit

10 次 IP

28303

PTMScan(R) Phospho-Ser/Thr-Pro Motif  [p(S/T)P] Kit

10 次 IP

25081

PTMScan(R) Phospho-Ser/Thr Motif [pS/T]  Kit

10 次 IP

71652

PTMScan(R) Phospho-PKC Substrate Motif  [(R/K)(R/K)Xp(S/T)X(R/X)] Kit

10 次 IP

5565

PTMScan(R) Phospho-PKA Substrate Motif (RRXS*/T*)  Kit

10 次 IP

10821

PTMScan(R) Phospho-PDK1 Docking Motif  [(F/Y)p(S/T)(F/Y)] Kit

10 次 IP

4652

PTMScan(R) Phospho-MAPK/CDK Substrate  Motif (PXS*P and S*PXK/R) Kit

10 次 IP

14990

PTMScan(R) Phospho-MAPK Substrate Motif  [PXpTP] Kit

10 次 IP

12170

PTMScan(R) Phospho-CK2 Substrate Motif  (S*/T*DXE) Kit

10 次 IP

12267

PTMScan(R) Phospho-ATM/ATR Substrate  Motif [pSQ] Kit

10 次 IP

5564

PTMScan(R) Phospho-AMPK Substrate Motif  (LXRXXS*/T*) Kit

10 次 IP

5563

PTMScan(R) Phospho-Akt Substrate Motif  mAb 2 (RXRXXS*/T*) Kit

10 次 IP

5561

PTMScan(R) Phospho-Akt Substrate Motif  mAb 1 (RXXS*/T*) Kit

10 次 IP

32948

PTMScan(R) Basophilic Kinase Substrate  Motif [(R/X)(R/X)Xp(S/T)] Kit

10 次 IP

 

表3：酰化修饰肽段富集磋磨抗体试剂

酰化修饰肽段 IP 富集试剂盒（用于卵白组学分析）

居品货号

居品称号

规格

14499

PTMScan(R) Pilot Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit

3次IP

13416

PTMScan(R) Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit

10次IP

13764

PTMScan(R) Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit

10次IP

捆绑 调教

17848

PTMScan(R) Propionyl-Lysine [Prop-K] Kit

10次IP

93872

PTMScan(R) Malonyl-Lysine [Mal-K] Kit

10次IP

26101

PTMScan(R) Glutaryl-Lysine [Glut-K] Kit

10次IP

 

表 4：泛素化及类泛素化修饰肽段富集磋磨抗体试剂 

泛素化及类泛素化修饰肽段 IP 富集试剂盒（用于卵白组学分析）

居品货号

居品称号

规格

14482

PTMScan(R) Pilot Ubiquitin Remnant  Motif (K-epsilon-GG) Kit

3 次 IP

5562

PTMScan(R) Ubiquitin Remnant Motif  (K-epsilon-GG) Kit

10 次 IP

 

表 5：甲基化修饰肽段富集及老例分析磋磨抗体试剂

甲基化修饰肽段 IP 富集试剂盒（用于卵白组学分析）

居品货号

居品称号

规格

14809

PTMScan(R) Pan-Methyl Lysine Kit

10 次 IP

12235

PTMScan(R) Mono-Methyl Arginine Motif [mme-RG]  Kit

10 次 IP

13563

PTMScan(R) Symmetric Di-Methyl Arginine Motif  [sdme-RG] Kit

10 次 IP

13474

PTMScan(R) Asymmetric Di-Methyl Arginine Motif  [adme-R] Kit

10 次 IP

86506

PTMScan(R) Lysine/Arginine Modification  Antibody Sampler Kit

10 次 IP

表 6：Caspase 切割肽段富集磋磨抗体试剂

Caspase 切割肽段 IP 富集试剂盒（用于卵白组学分析）

居品货号

居品称号

规格

12810

PTMScan(R) Cleaved Caspase Substrate Motif [DE(T/S/A)D] Kit

10 次 IP

 

质谱：可对已知修饰点进行高通量评估运用质谱除了关于未知的卵白修饰进行高通量评估之外，还能弗成对已知的修饰位点进行高通量评估呢？谜底是不错的。其实，CST 经过长久的探索和积攒，也仍是制备了针对已知修饰位点肽段进行富集的试剂 #75676（点击此处了解 #75676 的具体先容）用于质谱分析前的修饰肽段富集和纯化。况且，CST 也不错提供包括未知或已知修饰位点肽段富集和质谱分析的全套管事。磋磨小心信息色五月第二季，可下载《粗浅卵白组学》手册以及《翻译后修饰卵白质组学照看的新时期战略》进行阅读。

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